Overview of output files

The multiome-wf creates a results folder in the workflow directory upon completion of a run. All output files are saved in this directory.

results directory

The results folder contains subfolders and output files. Below is an example of the directory structure from a Multiome analysis:

$ tree workflow/results/
workflow/results/
├── add_macs_peaks
│   ├── report.html
│   └── seurat.rds
├── build_annotation
│   ├── annotation.rds
│   ├── report.html
│   └── report.md
├── chooser_plot
│   ├── integrated_0
│   │   ├── choice.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   ├── median_ci.xlsx
│   │   └── report.html
│   ├── integrated_1
│   │   ├── choice.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   ├── median_ci.xlsx
│   │   └── report.html
│   ├── integrated_3
│   │   ├── choice.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   ├── median_ci.xlsx
│   │   └── report.html
│   ├── intermediates_dir
│   ├── unintegrated_0
│   │   ├── choice.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   ├── median_ci.xlsx
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_1
│   │   ├── choice.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   ├── median_ci.xlsx
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_2
│   │   ├── choice.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   ├── median_ci.xlsx
│   │   └── report.html
│   └── unintegrated_3
│       ├── choice.rds
│       ├── clustered_data.rds
│       ├── median_ci.xlsx
│       └── report.html
├── chooser_run
│   ├── integrated_0
│   │   ├── frequency_grouped_0.6.rds
│   │   ├── frequency_grouped_0.8.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.2.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.4.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.rds
│   │   ├── res_0.6
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_0.8
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.2
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.4
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── seurat_obj_0.6.rds
│   │   ├── seurat_obj_0.8.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.2.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.4.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.rds
│   │   ├── silhouette_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_1.4.rds
│   │   ├── silhouette_1.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.4.rds
│   │   └── silhouette_grouped_1.rds
│   ├── integrated_1
│   │   ├── frequency_grouped_0.6.rds
│   │   ├── frequency_grouped_0.8.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.2.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.4.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.rds
│   │   ├── res_0.6
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_0.8
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.2
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.4
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── seurat_obj_0.6.rds
│   │   ├── seurat_obj_0.8.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.2.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.4.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.rds
│   │   ├── silhouette_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_1.4.rds
│   │   ├── silhouette_1.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.4.rds
│   │   └── silhouette_grouped_1.rds
│   ├── integrated_3
│   │   ├── frequency_grouped_0.6.rds
│   │   ├── frequency_grouped_0.8.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.2.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.4.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.rds
│   │   ├── res_0.6
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_0.8
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.2
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.4
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── seurat_obj_0.6.rds
│   │   ├── seurat_obj_0.8.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.2.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.4.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.rds
│   │   ├── silhouette_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_1.4.rds
│   │   ├── silhouette_1.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.4.rds
│   │   └── silhouette_grouped_1.rds
│   ├── intermediates_dir
│   │   ├── integrated_0
│   │   ├── integrated_1
│   │   ├── integrated_3
│   │   ├── unintegrated_0
│   │   ├── unintegrated_1
│   │   ├── unintegrated_2
│   │   └── unintegrated_3
│   ├── unintegrated_0
│   │   ├── frequency_grouped_0.6.rds
│   │   ├── frequency_grouped_0.8.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.2.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.4.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.rds
│   │   ├── res_0.6
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_0.8
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.2
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.4
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── seurat_obj_0.6.rds
│   │   ├── seurat_obj_0.8.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.2.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.4.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.rds
│   │   ├── silhouette_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_1.4.rds
│   │   ├── silhouette_1.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.4.rds
│   │   └── silhouette_grouped_1.rds
│   ├── unintegrated_1
│   │   ├── frequency_grouped_0.6.rds
│   │   ├── frequency_grouped_0.8.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.2.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.4.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.rds
│   │   ├── res_0.6
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_0.8
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.2
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.4
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── seurat_obj_0.6.rds
│   │   ├── seurat_obj_0.8.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.2.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.4.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.rds
│   │   ├── silhouette_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_1.4.rds
│   │   ├── silhouette_1.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.4.rds
│   │   └── silhouette_grouped_1.rds
│   ├── unintegrated_2
│   │   ├── frequency_grouped_0.6.rds
│   │   ├── frequency_grouped_0.8.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.2.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.4.rds
│   │   ├── frequency_grouped_1.rds
│   │   ├── res_0.6
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_0.8
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.2
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── res_1.4
│   │   │   └── report.html
│   │   ├── seurat_obj_0.6.rds
│   │   ├── seurat_obj_0.8.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.2.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.4.rds
│   │   ├── seurat_obj_1.rds
│   │   ├── silhouette_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_1.4.rds
│   │   ├── silhouette_1.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.6.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_0.8.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.2.rds
│   │   ├── silhouette_grouped_1.4.rds
│   │   └── silhouette_grouped_1.rds
│   └── unintegrated_3
│       ├── frequency_grouped_0.6.rds
│       ├── frequency_grouped_0.8.rds
│       ├── frequency_grouped_1.2.rds
│       ├── frequency_grouped_1.4.rds
│       ├── frequency_grouped_1.rds
│       ├── res_0.6
│       │   └── report.html
│       ├── res_0.8
│       │   └── report.html
│       ├── res_1
│       │   └── report.html
│       ├── res_1.2
│       │   └── report.html
│       ├── res_1.4
│       │   └── report.html
│       ├── seurat_obj_0.6.rds
│       ├── seurat_obj_0.8.rds
│       ├── seurat_obj_1.2.rds
│       ├── seurat_obj_1.4.rds
│       ├── seurat_obj_1.rds
│       ├── silhouette_0.6.rds
│       ├── silhouette_0.8.rds
│       ├── silhouette_1.2.rds
│       ├── silhouette_1.4.rds
│       ├── silhouette_1.rds
│       ├── silhouette_grouped_0.6.rds
│       ├── silhouette_grouped_0.8.rds
│       ├── silhouette_grouped_1.2.rds
│       ├── silhouette_grouped_1.4.rds
│       └── silhouette_grouped_1.rds
├── cluster
│   ├── integrated_0
│   │   ├── barcodes.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   └── report.html
│   ├── integrated_1
│   │   ├── barcodes.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   └── report.html
│   ├── integrated_3
│   │   ├── barcodes.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   └── report.html
│   ├── intermediates_dir
│   ├── unintegrated_0
│   │   ├── barcodes.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_1
│   │   ├── barcodes.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_2
│   │   ├── barcodes.rds
│   │   ├── clustered_data.rds
│   │   └── report.html
│   └── unintegrated_3
│       ├── barcodes.rds
│       ├── clustered_data.rds
│       └── report.html
├── combine
│   ├── report.html
│   └── seurat_combined.rds
├── create_seurat
│   ├── rep1_homo-nan.report.html
│   ├── rep1_homo-nan.seurat_raw.rds
│   ├── rep1_wt-nan.report.html
│   └── rep1_wt-nan.seurat_raw.rds
├── diff_analysis
│   ├── integrated_0
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   ├── integrated_1
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   ├── integrated_3
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_0
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_1
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_2
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   ├── unintegrated_3
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   ├── wnn_0
│   │   ├── markers.tsv
│   │   └── report.html
│   └── wnn_1
│       ├── markers.tsv
│       └── report.html
├── integrate
│   ├── integrated_0.rds
│   ├── integrated_0.report.html
│   ├── integrated_1.rds
│   ├── integrated_1.report.html
│   ├── integrated_3.rds
│   └── integrated_3.report.html
├── macs2
│   ├── macspeaks.tsv
│   ├── macspeaks.tsv.gz
│   ├── macspeaks.tsv.gz.tbi
│   ├── NA_control_lambda.bdg
│   ├── NA_control_lambda.bigwig
│   ├── NA_peaks.narrowPeak
│   ├── NA_peaks.xls
│   ├── NA_summits.bed
│   ├── NA_treat_pileup.bdg
│   └── NA_treat_pileup.bigwig
├── merge_macs_prep
│   ├── Multiome.bed
│   ├── report.html
│   └── seurat.rds
├── normalize_reduce_dims
│   ├── intermediates_dir
│   ├── unintegrated_0
│   │   ├── unintegrated_0.rds
│   │   └── unintegrated_0.report.html
│   ├── unintegrated_1
│   │   ├── unintegrated_1.rds
│   │   └── unintegrated_1.report.html
│   ├── unintegrated_2
│   │   ├── unintegrated_2.rds
│   │   └── unintegrated_2.report.html
│   └── unintegrated_3
│       ├── unintegrated_3.rds
│       └── unintegrated_3.report.html
├── qc
│   ├── rep1_homo-nan.report.html
│   ├── rep1_homo-nan.seurat_qc.rds
│   ├── rep1_wt-nan.report.html
│   └── rep1_wt-nan.seurat_qc.rds
└── wnn
    ├── wnn_0
    │   ├── barcodes.rds
    │   ├── clustered_data.rds
    │   └── report.html
    └── wnn_1
        ├── barcodes.rds
        ├── clustered_data.rds
        └── report.html

96 directories, 290 files

html summary files

Each html file is a summary file for each rule in the Snakefile. Users can review computational details, related metrics, and visualized data. For example, the html summary in the qc folder provides information about QC metrics, filtering thresholds, and the distribution of cells before and after QC filtering.

rds objects

Each rds contains an R object passed onto the next step. These objects may be intermediate/final Seurat objects, R strings, annotations saved as GenomicRanges. Ultimately, users are provided with the combined_seurat.rds file saved in the combine folder. This file contains a processed Seurat object, as shown in the following example:

## An object of class Seurat
## 870542 features across 15600 samples within 9 assays
## Active assay: SCT (20354 features, 3000 variable features)
##  3 layers present: counts, data, scale.data
##  8 other assays present: Gene.Expression, Peaks, MACS, Gene.Activity, integrated_0_SCT, integrated_1_Peaks, integrated_2_MACS, integrated_3_Gene.Activity
##  19 dimensional reductions calculated: SCT_pca, SCT_umap, Peaks_lsi, Peaks_umap, MACS_lsi, MACS_umap, Gene.Activity_pca, Gene.Activity_umap, pca, integrated_0_pca, integrated_0_umap, integrated_1_lsi, integrated_1_umap, integrated_2_lsi, integrated_2_umap, integrated_3_pca, integrated_3_umap, wnn_0_umap, wnn_1_umap

This Seurat object contains raw and normalized count matrices for all modalities, metadata, and reduced dimensions, which are available for further specialized analyses.

markers.tsv table

Marker genes are saved as excel-readable, tab-separated files named markers.tsv. These files are saved in per-modality sub-folders within the diff_analysis folder.

Below is an example of the first two rows from the markers.tsv computed in the unintegrated_1 assay group:

Gene	p_val	avg_log2FC	pct.1	pct.2	p_val_adj	cluster	group	assay	slot
chr4-95840476-95841400	0	2.60136012051654	0.443	0.084	0	0	seurat_clusters	Peaks	data
chr18-46109191-46110086	0	2.56059989117035	0.402	0.081	0	0	seurat_clusters	Peaks	data

The columns indicate the following:

• Gene: Gene symbol (RNA-seq) or locus (ATAC-seq)

• p_val: Raw p-values

• avg_log2FC: Log2-transformed fold changes

• pct.1, pct.2: Percentage of cells expressing each gene in cells annotated the cluster (pct.1) and not annotated to the cluster (pct.2)

• p_val_adj: Adjusted p-value, False Discovery Rate (FDR) calculated using the Benjamini-Hochberg procedure

• cluster: Cluster where the given marker gene is differentially expressed

• group: Metadata column used in differential testing

• assay: Modality

• slot: Count matrix used for differential testing (counts for raw data, data for normalized counts)

For computational details, refer to the FindAllMarkers function in Seurat.

MACS2 output

Optionally, users can call ATAC peaks using MACS2. Configure the MACS2 run as instructed in the MACS Peak Calling (macs2 section). The output files are summarized below:

• *_peaks.narrowPeak: Peak locations with peak summit, pvalue, and qvalue in BED6+4 format

• *_peaks.xls: A tabular file which contains information about called peaks, including pileup and fold enrichment

• *_summits.bed: Peak summit locations for every peak. Recommended when identifying motifs at the binding sites.

• *_control_lambda.bdg: fragment pileup saved in bedGraph; local lambda values from control

• *_treat_pileup.bdg: fragment pileup saved in bedGraph; values from treatment

• *_control_lambda.bigwig, *_treat_pileup.bigwig: bigwig coverage files converted from bedGraph

The remaining files (e.g. macspeaks.*) are pre-processed input files for MACS2 and are not considered as outputs of the peak calling process.